關(guān)于原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)
關(guān)于原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù) | 時(shí)間: December-7 11:20:04 | 分類(lèi):技術(shù)欄目
凌儀生物專(zhuān)業(yè)提供高速離心機(jī)，美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)電泳儀，德國(guó)eppendorf艾本德移液器，PCR基因擴(kuò)增儀，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，要省錢(qián)，別錯(cuò)過(guò)哦。關(guān)于原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)原位雜交組化（簡(jiǎn)稱原位雜交，in situ hybridizationhistochemistry；ISHH）屬于分子雜交的一種，是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞中的待測(cè)核酸雜交，再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測(cè)系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)。原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過(guò)堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測(cè)的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過(guò)探針上所標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來(lái)。
當(dāng)然雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來(lái)源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。
探針的種類(lèi)按所帶標(biāo)記物可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針兩大類(lèi)。目前，大多數(shù)放射性標(biāo)記法是通過(guò)酶促反應(yīng)將標(biāo)記的基因摻入DNA中，常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高，背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來(lái)有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素標(biāo)記物中目前較常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。
探針的種類(lèi)按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。cDNA探針又可分為雙鏈cDNA探針和單鏈cDNA探針。原位雜交又可分為菌落原位雜交和組織原位雜交。菌落原位雜交（Colony
in situ
hybridization）菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。
組織原位雜交（Tissue in situ
hybridization）組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。
（一）探針的選擇
根據(jù)不同的雜交實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類(lèi)型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測(cè)靶序列上的單個(gè)堿基改變時(shí)應(yīng)選用寡核苷酸探針，在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針（通過(guò)克隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長(zhǎng)的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交，因?yàn)樗灰淄高^(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標(biāo)記探針（80～150bp）具有較大的優(yōu)越性。
關(guān)于原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)在選用探針時(shí)經(jīng)常會(huì)受到可利用探針?lè)N類(lèi)的限制。如在建立DNA文庫(kù)時(shí)，手頭沒(méi)有篩選特定基因的克隆探針，這時(shí)就可用寡核苷酸探針來(lái)代替。但必須首先純化該基因的編碼蛋白，并測(cè)定6個(gè)以上的末端氨基酸序列，通過(guò)反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探針。如果已有其它動(dòng)物的同種基因克隆，因?yàn)槿祟?lèi)和動(dòng)物間在同一基因的核苷酸順序上存在較高的同源性，因此可利用已鑒定的動(dòng)物基因作探針來(lái)篩選人類(lèi)基因克隆。對(duì)于基因核苷酸序列背景清楚而無(wú)法獲得克隆探針時(shí)，可采用PCR方法擴(kuò)增某段基因序列，并克隆人合適的質(zhì)粒載體中，即可得到自己的探針。這種方法十分簡(jiǎn)便，無(wú)論基因組DNA探針還是cDNA探針都可以容易地獲得，而且，可以建立PCR的基因檢測(cè)方法，與探針雜交方法可作對(duì)比，可謂一舉兩得。
（二）探針的標(biāo)記方法
在選擇探針類(lèi)型的同時(shí)，還需要選擇標(biāo)記方法。探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實(shí)際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機(jī)引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性
。在檢測(cè)單拷貝基因序列時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。
（三）探針的濃度
總的來(lái)說(shuō)，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗(yàn)，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10
ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類(lèi)型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。
（四）雜交率
在探針過(guò)量的條件下，雜交率主要依賴于探針長(zhǎng)度（復(fù)雜度）和探針濃度。
（五）雜交較適溫度
雜交技術(shù)較重要的因素之一是選擇較適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm
10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即較適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對(duì)雜交的影響見(jiàn)表18-3。較適復(fù)性溫度（Optimunm
renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃
苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)
非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)
（六）雜交的嚴(yán)格性
影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體•（七）雜交反應(yīng)時(shí)間。在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot
=值來(lái)計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時(shí)間（t）的乘積。實(shí)驗(yàn)表明Cot=100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒(méi)有 雜交。例如在液相雜交中 未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時(shí)間為21h，那么對(duì)于未標(biāo)記的DNA來(lái)說(shuō)，Cot =9.6/21 =100.8,雜交完成了。對(duì)標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來(lái)說(shuō)Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。Tm值25℃時(shí)雜交較好，所以首先要根據(jù)公式（4）計(jì)算雜交體Tm 值。由此式可見(jiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié) 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性。 （八）雜交促進(jìn)劑
惰性多聚體可用來(lái)促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對(duì)單鏈探針可增加3倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長(zhǎng)雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500000。另一種常見(jiàn)的促進(jìn)劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量?。?000～8000）、粘度低、價(jià)格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，粘度低（MW=90000）。
小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過(guò)增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進(jìn)劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫氰酸胍可通過(guò)降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進(jìn)RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前較常用的雜交促進(jìn)劑。
（七）雜交反應(yīng)時(shí)間
在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot
=值來(lái)計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時(shí)間（t）的乘積。實(shí)驗(yàn)表明Cot
=100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒(méi)有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克
紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時(shí)間為21h，那么對(duì)于未標(biāo)記的DNA來(lái)說(shuō)，Cot =9.6/21 =100.8,
雜交完成了。對(duì)標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來(lái)說(shuō)Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。
Tm值25℃時(shí)雜交較好，所以首先要根據(jù)公式（4）計(jì)算雜交體
Tm 值。由此式可見(jiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié) 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性。
（八）雜交促進(jìn)劑
惰性多聚體可用來(lái)促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對(duì)單鏈探針可增加3倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小
，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長(zhǎng)雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500
000。另一種常見(jiàn)的促進(jìn)劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量?。?000～8000）、粘度低、價(jià)格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，粘度低（MW=90
000）。小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過(guò)增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進(jìn)劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫氰酸胍可通過(guò)降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進(jìn)RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制RNase的作用?？傊蛩崞暇厶呛途垡叶家蚰苡糜诠滔嚯s交是目前較常用的雜交促進(jìn)劑。
