Q-1:

　　LA PCR的反應(yīng)條件?

　　A-1:

　　因擴(kuò)增片段的大小、反應(yīng)體積、使用擴(kuò)增儀器的不同而不同。

　　◇ 循環(huán)次數(shù)

　　根據(jù)模板DNA的量以及擴(kuò)增片段的大小，設(shè)定25 ~ 30個(gè)循環(huán)。

　　如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足;如果循環(huán)次數(shù)太多，則會(huì)出現(xiàn)Smear。

　　◇ Anneal以及Extension

　　合適的Anneal溫度通常在45 ~ 68℃之間 (預(yù)備實(shí)驗(yàn)可2℃間隔進(jìn)行)。另外，由于TaKaRa LA Taq 在60 ~ 68℃間也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內(nèi)設(shè)定Anneal-Extension溫度, 進(jìn)行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時(shí)，每kbp大體可設(shè)定30秒 ~ 1分鐘;當(dāng)溫度設(shè)定在68℃以下時(shí), 時(shí)間設(shè)定可稍長(zhǎng)一些。通常，Anneal溫度太高，有時(shí)會(huì)得不到擴(kuò)增產(chǎn)物;Anneal溫度太低時(shí)，容易發(fā)生非特異性反應(yīng)。另外，Extension時(shí)間太短時(shí)，會(huì)得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或者會(huì)有一些短的非特異性產(chǎn)物優(yōu)先生成;而Extension時(shí)間太長(zhǎng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)Smear。

　　Q-2:

　　選擇LA PCR引物 (Primer) 時(shí)的注意事項(xiàng)?

　　A-2:

　　特異性非常重要。20mer左右的Primer, 如果特異性高，擴(kuò)增20 kbp沒(méi)有問(wèn)題，但如果可能的話，建議設(shè)計(jì)30 ~ 35mer左右。使用特異性低的Primer時(shí)，會(huì)出現(xiàn)很多非特異性產(chǎn)物。

　　Q-3:

　　LA PCR時(shí)酶的使用量?

　　A-3:

　　50 μl的反應(yīng)體系可使用2.5 U的TaKaRa LA Taq。但合適的用量也與模板DNA的量及Complexity、擴(kuò)增片段大小有關(guān)。酶量過(guò)多時(shí)，易發(fā)生非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)Smear;而酶量過(guò)少時(shí)，反應(yīng)性能下降。

　　Q-4:

　　LA PCR時(shí)模板DNA的調(diào)制方法?

　　A-4:

　　模板DNA的質(zhì)量是LA PCR成功與否的重要因素。擴(kuò)增超過(guò)10 kbp的DNA片段時(shí)，用簡(jiǎn)單的方法 (例如Cell只經(jīng)過(guò)加熱處理或Protease處理) 調(diào)制的DNA作模板不太合適， 建議使用充分精制的完整的DNA (沒(méi)有Nick等)。

　　Q-5:

　　是否可以對(duì)λ 噬菌體直接進(jìn)行LA PCR反應(yīng)?

　　A-5:

　　可以。99℃、10 min處理后的噬菌體約106 ~ 107 pfu作為模板，至少可擴(kuò)增8 kbp的DNA片段。

　　Q-6:

　　對(duì)Mammalian cell或E. coli 只進(jìn)行熱處理 (98℃， 2 min) 或Protease處理的樣品可否進(jìn)行LA PCR?

　　A-6:

　　◇ 對(duì)E. coli只進(jìn)行熱處理可擴(kuò)增10 kbp的DNA片段 (50 ml PCR反應(yīng)液中37℃ Overnight culture in L-both 使用2 μl)。

　　◇ Human細(xì)胞 (培養(yǎng)細(xì)胞) 如只經(jīng)過(guò)熱處理，可擴(kuò)增數(shù)百bp;經(jīng)過(guò)Protease處理、 熱處理后的樣品，較多可擴(kuò)增1 ~ 2 kbp。所以，如果要擴(kuò)增長(zhǎng)鏈DNA，建議使用經(jīng)過(guò)充分精制的完整的DNA作模板。

　　Q-7:

　　使用LA Taq是否也產(chǎn)生A的Overhang? (PCR產(chǎn)物是否可直接克隆于T-vector中?)

　　A-7:

　　可以。使用TaKaRa LA Taq 及TaKaRa Ex Taq 時(shí)的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生A的Overhang，與使用TaKaRa Taq 時(shí)的PCR產(chǎn)物克隆于T-vector 的效率基本相同。